Típico adolescente tímido, Peter Parker (Tobey Maguire) é considerado um nerd pelos colegas de escola. Os únicos que não o rejeitam é Harry Osborn (James Franco), seu melhor amigo, e a vizinha Mary Jane Watson, por quem nutre uma paixão. Órfão, foi criado pelos tios May e Ben. Sua vida vira de cabeça para baixo ao fazer uma excursão do colégio até o laboratório de ciências de uma universidade.

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Durante a visita, Peter é acidentalmente picado por uma aranha geneticamente modificada. Nos dias que se seguem, percebe que desenvolveu reflexos, músculos e que tem a capacidade de lançar teias. As dificuldades para se adaptar a este novo mundo são muitas, mas logo ele percebe o potencial que tem para ajudar as pessoas, especialmente depois que seu tio é morto por criminosos.

Paralelamente, o pai de seu melhor amigo Harry também ganha superpoderes graças a um experimento. Ele se transforma no maligno Duende Verde. Agora, é tarefa de Homem-Aranha combater este ameaçador inimigo, cuidar de sua tia May e ainda revelar a Mary Jane como se sente a seu respeito. Isso sem contar o trabalho de fotógrafo free-lancer que faz para um jornal, trazendo imagens exclusivas do aracnídeo em ação. Tudo isso sem jamais revelar sua real identidade a ninguém.